Entender o que é PCR digital é importante para acompanhar uma das abordagens mais precisas para quantificação de ácidos nucleicos. Também chamada de dPCR, a técnica divide uma amostra em numerosas reações independentes e determina quantas delas apresentam ou não o alvo molecular pesquisado.
Esse princípio permite realizar quantificação absoluta de DNA ou RNA sem depender de uma curva padrão externa, desde que o ensaio seja adequadamente desenvolvido e validado. A PCR digital pode ser aplicada em pesquisa genômica, detecção de variantes de baixa frequência, análise de número de cópias, expressão gênica e outras situações que exigem alta precisão na quantificação molecular.
A Pensabio reúne soluções em LifeScience para diferentes etapas da Biologia Molecular, incluindo sistemas, reagentes e equipamentos para PCR Digital.
PCR digital é uma técnica de amplificação e quantificação de ácidos nucleicos baseada no particionamento da amostra em numerosas pequenas reações independentes. Após a PCR, cada partição é classificada como positiva ou negativa para o alvo investigado.
Segundo o National Institute of Standards and Technology (NIST), a dPCR pode quantificar DNA, RNA e cDNA. O método utiliza partições físicas ou gotículas em emulsão e estima a quantidade inicial do alvo a partir do número de reações positivas e negativas, sem necessidade de curva padrão.
Essa característica diferencia a PCR digital de outros tipos de PCR e faz com que a técnica seja especialmente útil quando o objetivo envolve mensurar pequenas diferenças de concentração ou alvos presentes em baixa abundância.
Para compreender como a dPCR se encaixa entre as diferentes metodologias de amplificação, veja também o conteúdo da Pensabio sobre tipos de PCR.
A PCR digital funciona dividindo a mistura de reação em milhares de partições, realizando a amplificação separadamente e classificando cada uma como positiva ou negativa. Os resultados são então usados para estimar a concentração inicial do alvo.
De forma simplificada, o processo pode ser compreendido em quatro etapas:
Na modalidade Droplet Digital PCR, ou ddPCR, o particionamento é realizado em gotículas. No sistema QX200 uma reação pode ser separada em aproximadamente 20 mil gotículas antes da amplificação e da leitura individual de cada uma.
Como mais de uma molécula do alvo pode eventualmente estar presente na mesma partição, a estimativa da concentração utiliza modelos estatísticos apropriados, em vez de simplesmente igualar o número de partições positivas ao número de moléculas existentes na amostra.
PCR convencional, PCR Quantitativa (qPCR) e PCR digital compartilham o princípio de amplificação de regiões específicas de ácidos nucleicos, mas diferem principalmente na forma de detectar e quantificar o produto.
| Característica | PCR convencional | qPCR | PCR digital |
| Momento da detecção | Após a amplificação | Durante os ciclos | Após a amplificação de cada partição |
| Quantificação | Principalmente qualitativa ou semiquantitativa | Quantitativa | Quantificação absoluta |
| Particionamento | Não | Não | Sim |
| Curva padrão | Não é o foco da técnica | Pode ser necessária para quantificação absoluta | Não requer curva padrão externa |
| Resultado | Presença e análise do produto amplificado | Sinal de fluorescência ao longo dos ciclos | Número de partições positivas e negativas |
| Aplicações de destaque | Amplificação e identificação de alvos | Expressão gênica, quantificação e monitoramento | Baixa abundância, pequenas diferenças e variantes raras |
A qPCR, também chamada de PCR em tempo real, acompanha o aumento da fluorescência durante a reação. A Pensabio explica em seu conteúdo sobre PCR em tempo real que a técnica permite acompanhar a amplificação a cada ciclo e estimar a quantidade de material genético presente na amostra.
Já na dPCR, a informação é obtida após a classificação das partições. Essa diferença metodológica pode proporcionar vantagens em aplicações que demandam grande precisão quantitativa, embora a escolha entre qPCR e dPCR deva considerar o objetivo experimental, a concentração do alvo, o volume de amostras e o desenho do estudo.
A importância do PCR digital está principalmente na capacidade de realizar quantificação absoluta e investigar alvos moleculares em situações nas quais pequenas diferenças podem ser relevantes.
As diretrizes dMIQE, disponíveis pelo NIST e publicadas originalmente na Clinical Chemistry, destacam que a dPCR pode permitir quantificação precisa de ácidos nucleicos e auxiliar na mensuração de pequenas diferenças percentuais e variantes raras. As mesmas diretrizes reforçam que desenho experimental, controles e transparência metodológica continuam sendo fundamentais para produzir resultados robustos.
Entre as características que explicam a relevância da técnica estão:
Isso não significa que a dPCR substitua automaticamente outras metodologias. A qPCR, por exemplo, continua sendo adequada a inúmeras rotinas e pode apresentar vantagens de custo, rendimento e simplicidade dependendo da aplicação.
As principais aplicações da PCR digital envolvem quantificação de ácidos nucleicos, análise genética, detecção de variantes de baixa frequência, número de cópias, expressão gênica e apoio a fluxos de sequenciamento.
Na análise genética, a dPCR pode ser utilizada para investigar diferenças específicas em sequências de DNA.
A técnica é particularmente interessante quando uma variante está presente em baixa proporção em relação às sequências de referência. Segundo as diretrizes dMIQE, uma das aplicações relevantes da dPCR é justamente a quantificação de variantes raras.
Outro uso é a análise de copy number variation, ou CNV. Nesse caso, a técnica permite determinar a quantidade relativa ou absoluta de determinadas regiões genômicas e investigar ganhos ou perdas no número de cópias.
Quando o ponto de partida é RNA, uma etapa de transcrição reversa permite gerar cDNA antes ou durante o fluxo de PCR digital, dependendo da metodologia.
A análise pode então ser utilizada para quantificar transcritos e investigar níveis de expressão gênica. A Bio-Rad também inclui expressão gênica e análise de miRNA entre as aplicações descritas para sistemas ddPCR.
A PCR digital também pode fazer parte de determinadas etapas relacionadas ao sequenciamento de nova geração.
Entre as aplicações documentadas para ddPCR estão quantificação de bibliotecas de NGS e avaliação de amostras destinadas a fluxos de sequenciamento.
Quando há poucas cópias do alvo em relação ao material de fundo, o particionamento pode facilitar sua distinção.
Essa propriedade torna a dPCR interessante para pesquisas que envolvem alvos raros ou concentrações muito baixas, desde que amostragem, desenho do ensaio e quantidade de material disponível sejam compatíveis com o objetivo experimental.
A PCR digital tende a ser considerada quando a pesquisa exige quantificação absoluta, investigação de pequenas diferenças, detecção de alvos raros ou análise precisa de número de cópias.
A escolha, porém, não deve partir da ideia de que uma técnica é universalmente superior à outra.
A qPCR pode ser adequada para grandes volumes de análises, estudos de expressão gênica e diferentes aplicações quantitativas. Já a dPCR pode ser vantajosa quando a precisão em baixas concentrações ou a separação entre populações moleculares tem peso maior no objetivo experimental.
Assim, antes de selecionar a metodologia, é importante avaliar:
A Pensabio oferece equipamentos para PCR Digital e reagentes voltados a diferentes fluxos de Biologia Molecular. Em seu portfólio atual aparecem sistemas e componentes da tecnologia ddPCR da Bio-Rad, incluindo QX200 e QX One.
Entre as soluções relacionadas especificamente à PCR digital em gotas estão:
QX200 Droplet Digital PCR System
O sistema QX200 utiliza um fluxo no qual a amostra é particionada em gotículas, amplificada e posteriormente lida individualmente. O conjunto inclui gerador de gotículas, leitor e software para quantificação das partições positivas e negativas.
A Pensabio também disponibiliza separadamente o QX200 Droplet Generator, responsável pela geração das gotículas no fluxo de ddPCR.
QX One Droplet Digital PCR System
O QX One integra geração de gotículas, termociclagem e leitura em uma única plataforma automatizada. O sistema oferece detecção em quatro cores e operação integrada para aplicações de ddPCR.
Reagentes para ddPCR
O catálogo da Pensabio inclui ainda reagentes como ddPCR Supermix for EvaGreen e ddPCR Supermix for Probes, direcionados a diferentes estratégias de detecção em PCR digital.
A seleção de equipamentos, química de detecção, ensaio e consumíveis deve considerar as características da aplicação e o fluxo do laboratório. O suporte técnico especializado também é importante para avaliar qual configuração atende melhor aos objetivos experimentais.
Compreender o que é PCR digital ajuda a identificar em quais situações o particionamento e a quantificação absoluta podem agregar valor à pesquisa.
A dPCR não elimina a importância de outros métodos. Ela amplia o conjunto de ferramentas disponíveis para a Biologia Molecular e pode ser especialmente relevante em análise genética, variantes raras, número de cópias, expressão gênica e quantificação de ácidos nucleicos.
A Pensabio reúne tecnologias, reagentes e equipamentos para PCR Digital destinados a diferentes necessidades de pesquisa. A definição da solução mais adequada deve sempre partir do objetivo do experimento, do tipo de amostra e das características analíticas necessárias.
Além de entender o que é PCR digital, algumas dúvidas ajudam a esclarecer aspectos práticos da técnica e sua utilização no laboratório.
Não. Uma das características da dPCR é permitir a quantificação absoluta sem depender de uma curva padrão externa. Conforme o NIST, a concentração é estimada a partir da distribuição do alvo entre as partições e da quantidade de reações positivas e negativas.
dPCR é o termo geral para PCR digital. ddPCR, ou Droplet Digital PCR, é uma modalidade na qual a amostra é particionada em gotículas. Segundo o NIST, outras plataformas de dPCR podem utilizar câmaras físicas em dispositivos microfluídicos, enquanto a ddPCR emprega gotículas aquosas em uma emulsão.
Sim. O RNA pode ser analisado por fluxos que incorporam transcrição reversa para convertê-lo em cDNA antes da amplificação ou utilizam metodologias integradas de RT-dPCR.
Os sistemas de dPCR classificam as partições como positivas ou negativas e utilizam essas informações para estimar a concentração do alvo. Dependendo da plataforma e do software, os resultados podem ser apresentados como concentração de cópias por unidade de volume ou convertidos para outras medidas relacionadas ao experimento.
Qualidade da amostra, desenho de primers e sondas, controles positivos e negativos, número adequado de partições, definição de limiares e documentação das condições experimentais são alguns dos aspectos que precisam ser considerados.
De acordo com as diretrizes dMIQE, experimentos robustos de PCR digital dependem de desenho adequado, controles e descrição transparente dos procedimentos utilizados.
