A purificação de proteínas é o processo utilizado para separar uma proteína de interesse dos demais componentes presentes em uma amostra biológica. Essa etapa é fundamental em pesquisas bioquímicas, estudos estruturais, produção de proteínas recombinantes e diferentes aplicações biotecnológicas, já que a presença de contaminantes pode interferir na caracterização e no desempenho da molécula analisada.
O processo não se resume a uma única técnica. A estratégia pode combinar centrifugação, filtração, precipitação e diferentes modalidades de cromatografia de proteínas, de acordo com propriedades como tamanho, carga, afinidade e hidrofobicidade.
A purificação também está diretamente relacionada à expressão gênica. Para compreender como a informação presente no DNA resulta na síntese de proteínas, vale revisar os fundamentos da biologia molecular.
Purificação de proteínas é o conjunto de procedimentos utilizados para isolar uma proteína-alvo de outras moléculas presentes na amostra, buscando obter grau de pureza, concentração e integridade compatíveis com a aplicação desejada.
Materiais biológicos complexos, como células, tecidos e culturas, apresentam diversos constituintes que precisam ser separados para permitir a obtenção da proteína-alvo. O isolamento de proteínas explora diferenças físico-químicas entre essas moléculas para aumentar progressivamente a proporção da proteína de interesse.
Conforme revisão publicada por Paul Wingfield, do National Institutes of Health (NIH), o desenvolvimento de um protocolo de purificação de proteínas recombinantes deve levar em conta aspectos como solubilidade, localização da proteína no sistema de expressão e propriedades úteis para sua separação dos demais componentes da amostra.
O grau de purificação necessário varia conforme a finalidade. Uma proteína destinada a um ensaio exploratório pode exigir condições diferentes de uma amostra utilizada em estudos estruturais, funcionais ou outras aplicações que dependam de maior homogeneidade.
A purificação de proteínas funciona por etapas sucessivas que reduzem contaminantes e enriquecem a proteína-alvo, preservando, sempre que possível, sua estrutura e atividade.
O fluxo pode variar bastante, mas geralmente envolve:
Conforme o artigo do pesquisador Paul Wingfield, fatores como solubilidade, localização celular e propriedades físico-químicas da proteína devem ser considerados no planejamento da estratégia de purificação.
As técnicas de purificação de proteínas aproveitam diferenças entre as características das moléculas presentes na amostra. A purificação pode recorrer a diferentes abordagens, como cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, exclusão por tamanho e cromatografia por interação hidrofóbica.
| Técnica | Propriedade utilizada | Principal finalidade |
| Cromatografia de afinidade | Interação específica com um ligante | Captura seletiva da proteína-alvo |
| Troca iônica | Carga elétrica | Separação de proteínas com diferentes propriedades de carga |
| Exclusão por tamanho | Tamanho ou volume hidrodinâmico | Separação de proteínas e agregados de dimensões diferentes |
| Interação hidrofóbica | Hidrofobicidade | Separação conforme interações hidrofóbicas da superfície |
| Precipitação | Solubilidade | Concentração ou fracionamento inicial da amostra |
A cromatografia de afinidade separa proteínas de acordo com uma interação específica entre a molécula-alvo e um ligante presente na matriz cromatográfica.
É muito utilizada na purificação de proteínas recombinantes, sobretudo quando a proteína foi produzida com uma tag de afinidade.
Segundo uma revisão disponível no PubMed Central, as estratégias baseadas em afinidade tornaram-se amplamente utilizadas na purificação de proteínas recombinantes por possibilitarem a captura seletiva da molécula desejada.
A troca iônica explora diferenças de carga entre as proteínas. A interação com a matriz depende de fatores como pH e força iônica do tampão.
Conforme revisão científica sobre purificação de proteínas, essa técnica oferece elevada capacidade de ligação e pode ser utilizada tanto em etapas iniciais quanto intermediárias da purificação.
Também conhecida como SEC, a cromatografia por exclusão de tamanho separa moléculas de acordo com seu volume hidrodinâmico.
Proteínas maiores e menores percorrem a matriz de maneiras diferentes, permitindo separar a molécula de interesse de contaminantes com outros tamanhos. A técnica também pode auxiliar na remoção de agregados e na troca de tampão.
A cromatografia por interação hidrofóbica, ou HIC, explora diferenças na hidrofobicidade das proteínas.
A intensidade da interação com a matriz é modulada pelas condições do meio, especialmente pela concentração de sais. Por isso, a técnica pode ser combinada com outros métodos dentro de um processo de cromatografia de proteínas.
A purificação de proteínas recombinantes ocorre depois que a proteína de interesse é produzida por um sistema de expressão e precisa ser separada das moléculas do organismo hospedeiro.
Na produção de proteínas recombinantes, o gene que codifica a proteína desejada é introduzido em um sistema capaz de expressá-lo. Bactérias, leveduras, células de insetos e células de mamíferos estão entre as possibilidades, e a escolha influencia características do produto e do processo.
No conteúdo da Pensabio sobre proteínas recombinantes, o processo é apresentado como uma sequência em que, depois da etapa de expressão, a proteína de interesse passa por procedimentos de separação e avaliação para verificar suas características.
Em linhas gerais, esse fluxo pode envolver expressão, coleta do material, lise quando necessária, clarificação e uma ou mais etapas cromatográficas.
A proteína recombinante pode ser projetada com sequências de afinidade que permitem interações seletivas com determinadas matrizes, facilitando sua separação durante a purificação. Entretanto, a estratégia depende do objetivo do estudo e da necessidade de manter ou remover essa sequência após a purificação.
O resultado esperado são proteínas recombinantes purificadas em condições adequadas para a aplicação planejada, e não simplesmente a obtenção da maior quantidade possível de proteína.
A avaliação após a purificação verifica se a amostra apresenta pureza, identidade, integridade e outras características necessárias ao experimento.
A análise de proteínas pode combinar diferentes métodos. Um dos mais conhecidos é a eletroforese em gel, especialmente SDS-PAGE, que permite separar proteínas principalmente de acordo com sua massa molecular aparente e verificar o perfil de bandas da amostra.
Segundo uma revisão sobre qualidade de proteínas recombinantes, técnicas como SDS-PAGE e cromatografia por exclusão de tamanho podem integrar a caracterização de pureza, homogeneidade e qualidade do produto obtido.
Dependendo do objetivo, outras estratégias também podem ser utilizadas, como Western Blot, determinação da concentração da proteína e ensaios funcionais.
É importante diferenciar essas etapas. Purificar significa separar e enriquecer a proteína-alvo. Analisar significa avaliar características da amostra obtida. Em muitos fluxos, ambas são necessárias.
Veja também: Tipos de eletroforese
A escolha da estratégia de purificação depende das propriedades da proteína, da composição da amostra e da finalidade do produto final.
Antes de selecionar as etapas, é importante considerar aspectos como:
A combinação de métodos complementares costuma ser útil porque cada etapa explora uma propriedade diferente. Conforme revisão publicada no Journal of Molecular Recognition, aplicações que exigem níveis elevados de pureza frequentemente utilizam múltiplas etapas cromatográficas.
Ao mesmo tempo, acrescentar etapas sem necessidade pode reduzir o rendimento e aumentar o tempo do processo. O planejamento deve, portanto, buscar equilíbrio entre pureza, recuperação e manutenção da qualidade da proteína.
A Pensabio disponibiliza soluções em LifeScience para diferentes etapas dos estudos com proteínas, incluindo recursos voltados à separação, caracterização e aplicações com proteínas recombinantes.
Na frente de proteômica, o portfólio atual da empresa inclui soluções para cromatografia de proteínas. Entre elas estão:
O portfólio também contempla proteínas recombinantes. A BioLegend oferece proteínas recombinantes voltadas a diferentes aplicações de pesquisa, enquanto a linha Enzo inclui proteínas, enzimas, antígenos e toxinas nativas e recombinantes produzidas em diferentes sistemas de expressão.
As soluções disponibilizadas pela Pensabio podem integrar diferentes etapas dos fluxos experimentais com proteínas, desde a separação até a caracterização das amostras.
A purificação de proteínas permite reduzir interferentes e obter amostras adequadas para investigar propriedades estruturais, bioquímicas e funcionais das moléculas.
Na purificação de proteínas recombinantes, essa etapa conecta a produção da proteína à sua utilização experimental. Escolher corretamente as técnicas, avaliar a qualidade da amostra e combinar métodos de separação compatíveis com a molécula são cuidados essenciais para alcançar resultados reprodutíveis.
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A purificação de proteínas envolve decisões que variam conforme a molécula e a aplicação. A seguir, respondemos algumas dúvidas complementares sobre o processo.
No isolamento de proteínas, busca-se recuperar a molécula de interesse a partir de uma amostra complexa que contém outros componentes biológicos. A purificação envolve etapas adicionais destinadas a reduzir contaminantes e aumentar o grau de pureza da amostra. Na prática, os termos podem aparecer próximos, mas a purificação geralmente pressupõe um processo progressivo de enriquecimento da proteína-alvo.
Uma tag de afinidade é uma sequência adicionada à proteína durante sua construção molecular para facilitar etapas como detecção ou purificação. Ela pode interagir especificamente com uma matriz cromatográfica, permitindo separar a proteína recombinante de grande parte dos componentes da amostra. A necessidade de remover a tag depois depende da aplicação.
Não existe um número fixo. Uma proteína pode alcançar a pureza necessária com poucas etapas, enquanto outras exigem diferentes técnicas complementares. A complexidade depende da amostra inicial, das propriedades da molécula, do rendimento esperado e da pureza necessária.
Não. Pureza indica quanto da amostra corresponde à proteína desejada, enquanto rendimento representa quanto da proteína-alvo foi recuperado ao longo do processo. Uma estratégia de purificação de proteínas precisa considerar os dois parâmetros, pois aumentar a pureza por meio de muitas etapas também pode resultar em perdas de material.
Não. As propriedades das proteínas recombinantes podem variar em tamanho, carga, solubilidade, estabilidade e afinidade. Além disso, o sistema utilizado na produção interfere nos contaminantes presentes. Por isso, as condições e técnicas de purificação de proteínas precisam ser selecionadas e otimizadas para cada caso.
