A PacBio é uma empresa de biotecnologia especializada em tecnologias de sequenciamento genético, reconhecida principalmente pelo desenvolvimento de sistemas capazes de analisar fragmentos longos de DNA com elevada precisão. Sua tecnologia permite investigar regiões complexas do genoma, identificar variantes genéticas e aprofundar os estudos sobre a organização e o funcionamento do material genético.
Entre seus principais avanços está o sequenciamento HiFi, que combina leituras longas com alta precisão. Dessa forma, os pesquisadores conseguem obter informações mais completas sobre determinadas regiões do DNA, incluindo aquelas que apresentam sequências repetitivas ou alterações estruturais difíceis de caracterizar por métodos convencionais.
Para compreender como a tecnologia PacBio funciona, é importante conhecer os princípios do sequenciamento de leitura longa, suas diferenças em relação a outras metodologias e as aplicações na pesquisa científica.
PacBio é o nome comercial da Pacific Biosciences, empresa responsável pelo desenvolvimento de tecnologias avançadas de sequenciamento de DNA, com destaque para o sequenciamento de molécula única em tempo real.
Uma de suas principais contribuições é a tecnologia Single Molecule, Real-Time (SMRT), que permite acompanhar a incorporação de nucleotídeos durante a síntese de uma nova fita de DNA.
Ao contrário das metodologias que produzem predominantemente fragmentos curtos, o sequenciamento PacBio permite obter leituras de milhares de bases em uma única sequência.
Segundo o National Human Genome Research Institute (NHGRI), o sequenciamento de leitura longa, ou long read sequencing, facilita a reconstrução de regiões genômicas extensas, pois reduz a quantidade de fragmentos que precisam ser organizados computacionalmente para formar uma sequência contínua.
Nesse sentido, a tecnologia é especialmente relevante para pesquisas que exigem informações detalhadas sobre a estrutura do genoma e a identificação de alterações genéticas complexas.
O sequenciamento PacBio funciona por meio da observação da síntese de DNA em tempo real, utilizando sinais fluorescentes para identificar as bases incorporadas pela enzima DNA polimerase.
O processo utiliza a tecnologia SMRT, na qual moléculas individuais de DNA são analisadas em estruturas microscópicas presentes em um chip especializado.
Conforme a documentação técnica da PacBio, o procedimento pode ser organizado nas seguintes etapas:
Uma característica importante desse processo é que a leitura da molécula ocorre diretamente durante a síntese de DNA pela polimerase.
Além disso, as observações repetidas de um mesmo fragmento ajudam a reduzir os erros de sequenciamento, sendo essa uma das bases do funcionamento da tecnologia HiFi.
O sequenciamento HiFi é uma tecnologia de leitura longa desenvolvida pela PacBio que combina informações obtidas em múltiplas passagens pela mesma molécula de DNA para produzir sequências altamente precisas.
O termo HiFi vem de High Fidelity, ou alta fidelidade, e está relacionado à confiabilidade das leituras produzidas.
Conforme a PacBio, a tecnologia permite gerar leituras com precisão de 99,9% ou superior em condições adequadas, mantendo comprimentos que podem alcançar dezenas de milhares de bases.
Esse desempenho depende de fatores como a qualidade da amostra, o tamanho dos fragmentos, a química utilizada e as condições do experimento.
A tecnologia SMRT corresponde ao princípio de sequenciamento de molécula única em tempo real. Já o HiFi representa a estratégia utilizada para gerar leituras de alta precisão a partir das observações repetidas da mesma molécula.
Nesse processo, o DNA circular é percorrido diversas vezes pela polimerase. Posteriormente, um algoritmo reúne as informações para construir uma sequência consenso.
Esse procedimento é conhecido como Circular Consensus Sequencing (CCS).
Portanto, SMRT sequencing e PacBio HiFi estão relacionados, mas não representam exatamente o mesmo conceito. A tecnologia SMRT realiza a leitura molecular, enquanto o processamento por consenso permite obter os dados HiFi.
A principal diferença entre o PacBio HiFi e as tecnologias convencionais de leitura curta está no comprimento dos fragmentos sequenciados e na quantidade de contexto genético preservado em cada leitura.
No sequenciamento de nova geração baseado em leituras curtas, o DNA é fragmentado em sequências menores, que posteriormente precisam ser alinhadas ou montadas por ferramentas computacionais.
Já o sequenciamento de leitura longa permite analisar segmentos mais extensos, favorecendo a caracterização de determinadas regiões complexas.
| Característica | NGS de leitura curta | PacBio HiFi |
| Comprimento das leituras | Geralmente centenas de bases | Milhares a dezenas de milhares de bases |
| Identificação de variantes pequenas | Adequada a diversas aplicações | Também permite identificar SNVs e pequenas inserções e deleções |
| Variantes estruturais complexas | Podem exigir análises complementares | Leituras longas facilitam a caracterização |
| Regiões repetitivas | Podem apresentar dificuldades de alinhamento | Maior capacidade de atravessar regiões repetitivas |
| Montagem de genomas | Pode exigir maior reconstrução computacional | Favorece a obtenção de sequências contínuas |
| Precisão | Elevada em plataformas consolidadas | Elevada nas leituras HiFi |
Segundo o NHGRI, as leituras longas oferecem vantagens na montagem de sequências genômicas porque permitem trabalhar com fragmentos maiores, reduzindo determinadas ambiguidades de reconstrução.
Entretanto, isso não significa que o PacBio substitua todas as tecnologias de leitura curta. A escolha depende da finalidade da pesquisa, da quantidade de amostras, do rendimento necessário e das características das regiões que serão investigadas.
Vale destacar também que o termo NGS é utilizado de maneira ampla para tecnologias modernas de sequenciamento. Assim, o sequenciamento PacBio não deve ser tratado como uma categoria totalmente oposta ao sequenciamento de nova geração.
O sequenciamento PacBio pode ser aplicado à montagem de genomas, à identificação de variantes genéticas, à análise de transcritos, à investigação de modificações epigenéticas e aos estudos de microrganismos.
Essas aplicações são possíveis porque o sequenciamento HiFi combina informações de regiões extensas do material genético com elevada precisão.
Uma das aplicações mais relevantes está na identificação de alterações presentes no DNA.
O sequenciamento de leitura longa facilita a investigação de variantes estruturais, como inserções, deleções, inversões e determinadas reorganizações genômicas.
Além disso, a precisão do PacBio HiFi permite investigar variantes de nucleotídeo único e pequenas inserções e deleções.
Conforme a documentação da PacBio, essas características também favorecem o estudo de haplótipos, ou seja, conjuntos de variantes presentes em uma mesma cópia cromossômica.
Na montagem de genomas, as leituras longas ajudam a reconstruir sequências extensas a partir dos fragmentos obtidos durante o sequenciamento.
Isso é especialmente importante em regiões repetitivas, nas quais fragmentos curtos podem dificultar a identificação da posição correta de cada sequência.
Desse modo, a tecnologia pode contribuir para pesquisas sobre genomas humanos, animais, vegetais e microbianos, além de estudos sobre a diversidade genética.
O PacBio HiFi também pode ser utilizado em pesquisas de transcriptômica, permitindo investigar diferentes versões dos transcritos produzidos por um mesmo gene.
Na abordagem Iso-Seq, por exemplo, o RNA é convertido em DNA complementar (cDNA), que posteriormente pode ser preparado para o sequenciamento.
Segundo a PacBio, essa estratégia permite analisar transcritos completos, favorecendo a identificação de isoformas e eventos de processamento alternativo do RNA.
Consequentemente, os pesquisadores podem investigar com mais detalhes a diversidade dos transcritos presentes em diferentes células, tecidos ou condições experimentais.
Outra aplicação é a investigação de modificações químicas no DNA, como determinados padrões de metilação.
Essas alterações podem influenciar a regulação gênica sem modificar a sequência original das bases.
A tecnologia SMRT permite detectar sinais associados a modificações do DNA por meio das alterações na cinética da polimerase durante o sequenciamento.
Conforme a PacBio, essa abordagem permite combinar informações sobre a sequência genética com dados epigenéticos, dependendo das características do ensaio e dos recursos analíticos empregados.
O sequenciamento PacBio também pode contribuir para a caracterização de genomas microbianos e para a investigação de comunidades de microrganismos.
As leituras longas favorecem a montagem de genomas, a análise de regiões repetitivas e a diferenciação de determinadas sequências relacionadas.
Essas aplicações são relevantes tanto para pesquisas microbiológicas quanto para estudos de biodiversidade, evolução e caracterização genética de microrganismos.
As principais vantagens da tecnologia PacBio estão na obtenção de leituras longas e precisas, na caracterização de variantes complexas e na análise de regiões genômicas difíceis de investigar por métodos convencionais.
Entre os benefícios do sequenciamento PacBio HiFi, destacam-se:
Entretanto, existem limitações que precisam ser consideradas.
A qualidade do material genético é especialmente importante, tendo em vista que a integridade da amostra influencia o comprimento das moléculas disponíveis para a análise. Além disso, o investimento em equipamentos, reagentes, infraestrutura e processamento computacional deve ser avaliado de acordo com o projeto.
Sendo assim, a seleção da tecnologia precisa considerar tanto os benefícios analíticos quanto as necessidades práticas do laboratório.
Entre os principais sistemas atuais da PacBio para sequenciamento HiFi estão o Revio e o Vega, que atendem a diferentes necessidades de capacidade e organização dos fluxos laboratoriais.
O Revio é uma plataforma de sequenciamento HiFi desenvolvida para estudos que demandam maior capacidade de processamento.
O equipamento permite operar múltiplas SMRT Cells em uma mesma execução, sendo adequado a projetos que precisam analisar grandes volumes de material genético.
Dessa forma, pode ser utilizado em pesquisas genômicas de maior escala, incluindo estudos populacionais e projetos de sequenciamento de genomas.
O Vega é um sistema de bancada que utiliza a tecnologia HiFi, com foco em laboratórios que buscam incorporar o sequenciamento de leitura longa aos próprios fluxos experimentais.
Sua configuração compacta e a operação com uma SMRT Cell por execução permitem atender a diferentes demandas de pesquisa.
De acordo com a PacBio, ambos os sistemas utilizam a tecnologia HiFi, embora apresentem diferenças de capacidade, configuração e rendimento.
A escolha entre eles deve considerar a quantidade de amostras, as aplicações previstas e os recursos disponíveis no laboratório.
A Pensabio oferece tecnologias para pesquisas em genômica e biologia molecular, incluindo soluções de tipagem HLA por NGS cujos fluxos de preparação de bibliotecas apresentam compatibilidade com plataformas PacBio.
Integrante do Grupo Pensalab, a Pensabio atua no mercado brasileiro de Life Sciences, disponibilizando equipamentos, reagentes e suporte técnico-científico para laboratórios, universidades e centros de pesquisa.
Seu portfólio reúne soluções em LifeScience voltadas a diferentes áreas, como Biologia Molecular, Genômica, Imunologia e Diagnóstico.
Na área de soluções de genômica, a empresa oferece recursos para genotipagem em larga escala, expressão gênica, estudos de célula única e outras aplicações que envolvem informações moleculares.
Uma relação direta com a tecnologia PacBio aparece nas soluções da GenDx para tipagem de HLA.
A Pensabio disponibiliza kits de tipagem de HLA por NGS da GenDx, destinados à análise de genes relacionados ao sistema de antígenos leucocitários humanos.
Esses genes apresentam elevada variabilidade genética, sendo sua caracterização importante para pesquisas imunogenéticas e avaliações de histocompatibilidade.
O fluxo disponível no portfólio inclui kits de amplificação NGSgo e reagentes para a preparação de bibliotecas, como o NGSgo LibrX.
As bibliotecas produzidas por esse processo podem ser utilizadas em plataformas de sequenciamento compatíveis, incluindo sistemas Illumina, Ion Torrent e PacBio, conforme a configuração do ensaio.
Além disso, a linha GenDx conta com o software NGSengine, destinado à análise de dados de sequenciamento para tipagem HLA.
Essa compatibilidade demonstra como tecnologias utilizadas em etapas anteriores ao sequenciamento podem integrar projetos que envolvem diferentes plataformas.
Entretanto, a compatibilidade das bibliotecas com equipamentos PacBio não significa, necessariamente, que a Pensabio comercialize os sequenciadores da fabricante.
A contribuição da Pensabio está no fornecimento das soluções efetivamente presentes em seu portfólio e no suporte técnico especializado para sua utilização.
O avanço do sequenciamento PacBio amplia as possibilidades de investigação genética, especialmente em estudos que exigem leituras longas, precisão e caracterização de regiões complexas do DNA.
Nesse cenário, a escolha dos equipamentos, reagentes e metodologias deve considerar as necessidades de cada pesquisa, desde a preparação das amostras até a interpretação dos resultados.
A Pensabio disponibiliza tecnologias de alta performance e suporte técnico-científico para diferentes aplicações em Life Sciences, contribuindo para a organização de fluxos laboratoriais mais eficientes e confiáveis.
Para conhecer as soluções disponíveis e avaliar quais produtos podem atender às necessidades do seu laboratório, entre em contato e converse com a equipe especializada.
O sequenciamento PacBio envolve diferentes conceitos relacionados à qualidade do DNA, aos recursos computacionais e à preparação das amostras. A seguir, confira respostas para algumas dúvidas complementares sobre a tecnologia.
A integridade do DNA influencia o tamanho dos fragmentos disponíveis para o sequenciamento. Em aplicações que exigem leituras longas, amostras muito fragmentadas podem limitar a obtenção de sequências extensas.
Por isso, o preparo deve considerar a qualidade e a integridade do material genético, conforme as exigências do protocolo utilizado.
Q30 é um indicador de qualidade que corresponde a uma probabilidade estimada de erro de uma base a cada mil bases, ou seja, aproximadamente 99,9% de precisão.
No sequenciamento HiFi, essa referência é utilizada para descrever a elevada confiabilidade das leituras produzidas. Entretanto, a qualidade efetiva depende das condições do experimento e dos métodos de processamento.
A leitura de moléculas individuais pela tecnologia SMRT não exige amplificação por PCR durante o sequenciamento.
Entretanto, determinados protocolos de preparação de bibliotecas, especialmente em aplicações direcionadas, podem incluir etapas de amplificação antes da análise.
O SMRT Link é uma plataforma desenvolvida para organizar diferentes etapas dos fluxos de sequenciamento PacBio.
O software permite configurar experimentos, acompanhar execuções e acessar recursos de análise computacional dos dados gerados pelos sistemas compatíveis.
Sim, dependendo da metodologia, da química e do protocolo de preparação utilizado.
Alguns fluxos foram desenvolvidos para trabalhar com quantidades reduzidas de material genético. Entretanto, os requisitos variam conforme a aplicação, de modo que a quantidade mínima de DNA deve ser verificada na documentação específica do ensaio.
