O desenvolvimento do sequenciamento de nova geração (NGS, Next Generation Sequencing) revolucionou a pesquisa científica permitindo análises de sequências de DNA em larga escala e a um custo relativamente baixo. Muitas foram as tecnologias desenvolvidas nesse período – pirosequenciamento, sequenciamento por ligações, metodologia de semicondutores, sequenciamento de moléculas únicas e sequenciamento por síntese.
Entretanto, a tecnologia de NGS ainda apresenta limitações, principalmente na detecção de variantes de baixa frequência (< 1%), devido às altas taxas de erros de sequenciamento (> 0,1-1%), podendo ser bastante considerável quando a qualidade e quantidade do material inicial for limitante. Estes erros podem ser introduzidos em várias etapas de um fluxo de trabalho de NGS convencional, como manuseio da amostra, preparo de biblioteca, enriquecimento por PCR e sequenciamento.
A MGI, subsidiária da BGI – a maior empresa de genoma do mundo -, oferece sequenciadores de alta performance, de médio e alto throughput que utilizam uma tecnologia de última geração denominada DNBSEQTM. Esta tecnologia utiliza a síntese de ancoragem por sondas combinatórias, sistema de imageamento fluídico e algoritmos exclusivos para a chamada de base.
Da esquerda para direita: Figura 1 – Tecnologia de sequenciamento DNBSEQTM.
Essa tecnologia combina ainda as vantagens de baixas taxas de erros de amplificação a partir de Nanobolas de DNA (DNBs) e de arranjos padronizados de alta densidade. Como consequência, a precisão do sequenciamento melhora consideravelmente e as taxas de duplicação são muito menores. Além disso, há uma redução na taxa de index hopping (quando o índice de uma amostra é trocado pelo índice de outra amostra em uma mesma corrida) com as plataformas DNSEQTM quando comparadas às demais plataformas disponíveis no mercado.
Mas no que consiste esta tecnologia? Após o preparo das bibliotecas, é realizada uma etapa de circularização do DNA fita simples (ssDNA). Para isso, o DNA dupla-fita (dsDNA) contendo as sequências adaptadoras nas extremidades é desnaturado por aquecimento. Em seguida, um oligonucleotídeo splint contendo uma sequência complementar a ambas extremidades 5’ e 3’ de uma fita do dsDNA alvo hibridiza formando um círculo (figura 1 – esquerda). As extremidades do círculo são então ligadas por uma ligase de DNA.
As DNBs são geradas através de amplificação em círculos utilizando o círculo de fita simples como molde (figura 1 – direita). A concentração de DNBs pode ser facilmente quantificada por Qubit ssDNA antes de submeter ao sequenciamento. O benefício principal da amplificação em círculos é a redução de erros introduzidos durante as etapas de PCR tradicional, uma vez que cada amplificação utiliza a cópia original de DNA circular como molde, além do uso de uma DNA polimerase de alta fidelidade – Phi29.
Ademais, esta tecnologia evita o acúmulo exponencial de erros, GC biases e dropouts observados com outras metodologias de amplificação como PCR. Todos esses fatores contribuem para um sequenciamento mais preciso com as plataformas DNBSEQTM.
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